Новости
Ученые требуют переподчинить ФАНО РАН
Новости Вставить в блог Код: Превью:  Понедельник, 25 июля 2016 Г. Коллективное открытое письмо на имя

Serpregion.ru - Заблокированы крупнейшие новостные порталы Серпуховского региона
Вечером 1 августа Роскомнадзор заблокировал доступ к интернет-порталу газеты «Ока-инфо». Причина внесения сайта издания в т.н. «реестр запрещённых» довольно спорная. Нынешней весной в правоохранительные

Пермские врачи возмущены новостью Минздрава о чудесном спасении пациентки
09 августа 2016 18:04 Общество, Здоровье Стали известны подробности спасения 23-летней девушки, которая пробыла в состоянии клинической смерти около 9 минут. Как выяснилось, пациентку вернула к

Современная медицина позволяет людям со статусом «ВИЧ положителен» вести обычную жизнь
Мировая медицина достигла больших успехов в лечении ВИЧ-инфекции. Теперь, получая необходимую терапию, люди с таким диагнозом живут полноценной жизнью, что особенно важно для детей и подростков. Подростки,

На общем собрании РАН предложили переподчинить ФАНО президиуму Академии
МОСКВА, 23 марта. /ТАСС/. Вице-президент Российской академии наук и председатель Сибирского отделения РАН академик Александр Асеев предложил переподчинить Федеральное агентство научных организаций (ФАНО)

Иссякание благолепия
Профсоюз РАН звонит во все колокола, прося о сохранении ведомственных медицинских учреждений. Недавняя беседа президента РАН академика Фортова с Владимиром Владимировичем обнадёжила: Путин заметил, что

Наш гость -- Лев Щукин, Протвино
Узнавай настороженности миллионным на www. novostiazyfikoz.intergun.ru  ••• Комментировать0. Обрати Серпухов. Главные колки региона. Инволюции Серпухова: Снаряжения.   В Протвино взошли велосипедиста.

Витилиго 2017:новое в лечении. Новости медицины, лекарства здесь!
Витилиго 2017: восстановить пигментацию кожи помогает тофацитиниб, а также сочетание метилпреднизолона и ультрафиолета 311 нм. Кроме того, есть результат 10-летнего исследования: обнаружены гены витилиго.

Витилиго: причины и лечение
Витилиго — это довольно распространённое заболевание кожи. Всего насчитывается около четырех процентов жителей планеты, которые им страдают. Витилиго проявляется в виде хаотично разбросанных по всему

Пермская медицина входит в десятку худших в стране
К таким выводам пришли активисты Народного фронта, совершая поездки по муниципалитетам Пермского края, посещая медицинские учреждения, проводя мониторинг удовлетворенности населения медицинской помощью,

Реклама

Трехмерный анализ рибонуклеопротеиновых комплексов в вирусе гриппа А

  1. 3-D структура восьми RNP в зародышевых вирионах Используя STEM, мы исследовали тонкие срезы (толщиной...
  2. Организация восьми РНП в многосегментных комплексах
  3. Томографические анализы вирионов при почковании

3-D структура восьми RNP в зародышевых вирионах

Используя STEM, мы исследовали тонкие срезы (толщиной около 200 нм) инфицированных вирусом клеток и захватили области, представляющие интерес для трехмерной реконструкции ( Дополнительный рис. S1 ). Серия томограмм вирионов-потомков показывает, что все исследованные вирионы содержали палочковидные РНП диаметром приблизительно 12 нм ( рисунок 1 ; Дополнительный фильм 1 ). Вирионы потомства с поперечными сечениями четко показывают восемь RNP, расположенных по определенной схеме, в которой центральный RNP окружен семью RNP ( Дополнительный фильм 1 ), как продемонстрировано ранее с использованием обычного ультратонкого сечения ЭМ 8 , 12 , Последовательные томограммы толщиной 0,5 нм через весь вирион с интервалами 5,0 нм, которые были получены в вычислительном отношении из трехмерного реконструированного вириона, демонстрируют, что все восемь RNP связаны с внутренней частью зародышевого фронта вириона и что восемь RNPs отличаются по длине, с тремя длинными RNP одинаковой длины ( Рис. 1а ), в соответствии с длиной восьми сегментов вРНК 1 , Восемь RNP кажутся хорошо организованными; однако последовательные изображения через ось z вириона случайным образом отображают постепенное смещение каждого поперечного сечения RNP ( Рис. 1а ; Дополнительный фильм 2 ), указывая, что они не расположены строго с семичечной симметрией. Эти результаты изображают трехмерную модель RNPs в вирионах потомства; восемь RNP внутри вириона хорошо организованы, но расположены асимметрично, и соответствующие RNP не являются прямыми стержнями, но представляют собой гибкие структуры с изогнутой змеиной структурой, что согласуется с исследованием, показывающим, что олигомеризация нуклеопротеинов опосредуется гибкой хвостовой петлей 13 , Восемь RNP плотно упакованы в липидную оболочку, которая покрыта шипами гликопротеина, выступающими наружу от поверхности ( Рис. 1б ; Дополнительные фильмы 3 и 4 ). Некоторые периферические RNPs, по-видимому, связаны с липидной оболочкой, как сообщалось ранее. 14 ( Рис. 1а ), хотя биологическое значение этой ассоциации неясно.

Рисунок 1: Двухосевая СТЭМ томография потомства вируса гриппа А.Рисунок 1: Двухосевая СТЭМ томография потомства вируса гриппа А

( а ) Последовательные поперечные срезы вириона потомства (толщиной 0,5 нм с интервалами 5,0 нм) от его верха до низа. RNPs, диаметром приблизительно 12 нм, присутствуют в вирусной оболочке. Типичные ассоциации между RNP показаны в качестве примеров (стрелки). Масштабная линейка, 50 нм. ( б ) трехмерная модель восьми RNP в вирионе. Каждый RNP и вирусная оболочка представлены разными цветами.

Взаимодействие между восемью RNP внутри вирионов

Поскольку взаимодействия между RNP необходимы для формирования и поддержания конкретного расположения восьми RNP, мы затем искали физические ассоциации между восемью RNP. Томограммы (толщиной 0,5 нм), в которых перекрывающиеся элементы, вызванные двумерной проекцией в трехмерных объектах, практически ничтожны, выявили частые прямые контакты между RNP ( Рис. 1а , наконечники стрел). Эти контакты наблюдались между периферическими RNPs, а также между центральными и периферическими RNPs по всему вириону. Мы также нашли связи между RNP через короткие струноподобные структуры ( Рис. 2 , Дополнительный рис. S2 ; Дополнительный фильм 2 ). Эти короткие струноподобные структуры имели диаметр приблизительно 2 нм и длину не более 10 нм, так что они связывали только соседние RNP ( Рис. 2 ; Дополнительный рис. S2 , наконечники стрел). Важно отметить, что подобные струнные структуры всегда находились между RNP; они никогда не наблюдались диссоциированными от RNPs в вирионах. Эти результаты показывают, что, хотя конкретный паттерн взаимодействия не был обнаружен, между восемью RNP существуют физические мульти-взаимодействия, возможно, участвующие в их избирательной упаковке генома. 15 , 16 , 17 , Хотя природа этих коротких нитевидных структур остается неизвестной, их существование в качестве линкеров RNP потенциально важно, потому что их форма фибрилл напоминает форму РНК 18 , Известно, что РНК распознаются как структуры, а также нуклеотидные последовательности. 19 , 20 , который может сортировать восемь сегментов вРНК посредством специфических взаимодействий РНК-РНК с сегментно-специфическими сигналами упаковки, которые существуют на восьми сегментах вРНК 15 , 16 , 17 ,

Рисунок 2: Связи между восемью RNP в вирионе.Рисунок 2: Связи между восемью RNP в вирионе

Короткие струноподобные структуры диаметром около 2 нм можно увидеть между RNP (стрелками). Томограммы толщиной 0,5 нм показаны в верхнем ряду. Трехмерные модели двух RNP, соединенных струнной структурой, показаны в нижнем ряду. Номера виртуальных срезов (1, 5 и 9) томограмм толщиной 0,5 нм приведены над томограммами. Цветовая схема RNP такая же, как показано в Рисунок 1b , Масштабная линейка, 50 нм.

Организация восьми РНП в многосегментных комплексах

Основным преимуществом электронной томографии по сравнению с обычными ультратонкими ЭМ является доступность трехмерной пространственной информации. Чтобы определить, является ли структурное расположение восьми RNP распространенным среди различных вирионов потомства, мы создали трехмерные модели многосегментного комплекса из 30 вирионов потомства, которые были выбраны случайным образом. Все вирионы содержали восемь RNP, расположенных по определенной схеме, что позволяет предположить, что восемь RNP обычно упакованы в вирионы потомства. В большинстве исследованных вирионов нижние концы трех длинных RNP не были включены в срезы толщиной 200 нм и, таким образом, были обрезаны в трехмерных моделях; остальные пять RNP были полностью включены в разделы и успешно реконструированы. Рисунок 3 показывает, как многосегментный комплекс немного отличался среди вирионов, хотя все они сохранили расположение 7 + 1. В некоторых многосегментных комплексах RNPs, по-видимому, объединяются на вершине вириона ( Рис. 3а, б ), тогда как в других случаях каждый RNP был ориентирован почти перпендикулярно вершине вириона и, казалось, был изолирован от своего соседа ( Рис. 3в, д ), предполагая, что трехмерная архитектура многосегментного комплекса неоднородна среди вирионов. Учитывая, что нуклеопротеиновый олигомер проявляет присущую ему гибкость 13 Вполне вероятно, что архитектура многосегментного комплекса не будет жесткой в ​​живых вирионах.

Рисунок 3: трехмерные модели восьми RNP в разных вирионах.Рисунок 3: трехмерные модели восьми RNP в разных вирионах

( a? d ) Показаны четыре примера трехмерных моделей многосегментного комплекса. Схемы, показанные в правом столбце, показывают порядок восьми RNP, которые пронумерованы от 3 до 8 в порядке убывания длины (то есть 3, 3, 3, 4, 5, 6, 7 и 8). Для ясности четыре более длинных RNP (то есть номера 3, 3, 3 и 4) окрашены в красный цвет, а четыре более коротких RNP (то есть номера 5, 6, 7 и 8) окрашены в серый цвет.

Чтобы дополнительно охарактеризовать архитектуру многосегментного комплекса в пределах вирионов потомства, мы рассмотрели порядок конфигурации восьми RNP на основе их различной длины. Восемь RNP были пронумерованы в порядке убывания длины. Поскольку концы трех длинных RNP часто исключали из срезов толщиной 200 нм, всем трем длинным RNP был присвоен номер 3, а другим пяти RNP различной длины были назначены разные номера (то есть восемь RNP были присваиваются номера 3, 3, 3, 4, 5, 6, 7 и 8, где 3 назначается самым длинным RNP, а 8 - самым коротким). Различия в длине между номерами 4 и 5, 5 и 6, 6 и 7 и 7 и 8 сегментами составляли 9,9 ± 2,1, 4,1 ± 1,9, 3,7 ± 1,9 и 6,9 ± 2,4 нм соответственно ( Дополнительный рис. S3a ). На основании этих измерений различия в длине между соответствующими парами RNP были схожими среди 30 вирионов, рассмотренных здесь, что свидетельствует о надежности назначения восьми RNP. Кроме того, мы обнаружили, что различия в длине между номерами сегментов 4 и 8, 5 и 8, 6 и 8 и 7 и 8 были статистически значимыми ( Дополнительный рис. S3b ), указывая, что более короткие пять RNP (то есть сегменты 4, 5, 6, 7 и 8) отличаются по длине. Вместе с наблюдением, что все рассматриваемые здесь вирионы содержат три длинных RNP, эти данные убедительно свидетельствуют о том, что начинающие вирионы содержат восемь различных RNP.

Порядок восьми RNP в многосегментном комплексе был разным среди всех 30 вирионов, исследованных здесь ( Рис. 3 ; Дополнительный Рис. S4 ). Тем не менее, центральный RNP в конкретном расположении был неизменно длинным (число 3 или 4) с вероятностью <0,001% (см. Методы), что свидетельствует о некоторой структурной роли центрального RNP. Кроме того, оставшиеся три длинных RNP не выстраивались последовательно среди семи периферийных RNP ( Дополнительные рисунки S4 и S5b ). Хотя три длинных RNP могут теоретически выстраиваться последовательно в семи периферийных положениях ( Дополнительный рис. S5a ) В 20% случаев такая договоренность не была обнаружена в 30 вирионах, которые мы рассмотрели здесь ( Рис. 3 ; Дополнительный Рис. S4 ). Эта вероятность составляет <0,124% (см. Методы), предполагая, что эти длинные RNP имеют некоторые структурные роли или ограничения. Вместе наши результаты демонстрируют, что положения восьми RNP внутри вирионов имеют характерную картину. Наши результаты также подразумевают, что взаимодействия между восемью RNP ограничены, и маловероятно, чтобы каждый RNP взаимодействовал со всеми соседними RNP до уровня, который бы полностью определял его положение в вирионах. Центральный RNP может не связываться конкретно со всеми периферийными RNP, и каждый периферийный RNP может не иметь конкретного взаимодействия с соседними RNP, в противном случае порядок восьми RNP должен быть одинаковым во всех вирионах. Механизмы, посредством которых такие ограниченные взаимодействия избирательно располагают восемь различных сегментов вРНК, остаются неясными.

Томографические анализы вирионов при почковании

Наконец, чтобы исследовать процесс упаковки восьми RNP в вирионы потомства, мы использовали иммуно-ЭМ и СТЭМ томографию для изучения вирионов, образовавшихся во время отпочковывания от поверхностей инфицированных клеток (обозначенных как превирионы). Иммуно ЭМ с антителами против NP, HA или M2 продемонстрировали, что для вирионов на начальной и средней фазе почкования белки вирусных шипов (HA, M2 и, возможно, NA) были обнаружены на выпуклых мембранах, под которыми были обнаружены RNP ( Рис. 4a – c левый и средний столбцы). Срезы сляба (толщиной 10 нм) показали, что вирусные колосковые белки были обнаружены исключительно в верхней части вириона на начальной стадии почкования ( Рис. 4d , левый столбец и Дополнительный рис. S6a ); остальная часть превириональной мембраны и плазматическая мембрана, проксимальные к превирионам, были гладкими, без вирусных спайковых белков. Даже на средней стадии почкования белки вирусных шипов были ограничены верхними и средними частями превирионов ( Рис. 4d , средний столбец и Дополнительный рис. S6b ). RNPs были подвешены на вершине вириона, где были прикреплены вирусные шиповые белки ( Рис. 4d (средний столбец), предполагая, что белки вирусных шипов, вероятно, участвуют в распознавании и ассоциации с RNPs на плазматической мембране, что подразумевается в вирусологических исследованиях 21 , 22 , В отличие от предшественников в процессе почкования, зрелые вирионы продольного сечения были почти полностью покрыты вирусными шиповыми белками ( Рис. 4d правая колонка и Дополнительный рис. S6c ). Их RNPs были связаны с внутренней оболочкой в ​​верхней части зрелого вириона, что согласуется с нашими результатами предшественника в ходе почкования ( Рис. 4d левый и средний столбцы). Учитывая, что экспрессия HA, NA или M2 сама по себе может образовывать вирусоподобные частицы 23 , 24 , 25 Наши наблюдения указывают на две независимые роли вирусных спайковых белков в образовании вирионов. На начальной стадии образования вирионов вирусные трансмембранные белки (HA, NA и M2) распознают RNP. За этим событием следует образование оболочки вириона, обусловленное вирусными трансмембранными белками и белком М1, которые обладают внутренней способностью образовывать оболочку вириона 25 , 26 , 27 , 28 , что приводит к включению RNPs в вирионы.

Рисунок 4: Упаковка RNP в вирион.Рисунок 4: Упаковка RNP в вирион

В левом столбце показана начальная стадия образования почек, в среднем столбце - средняя стадия, а в правом столбце - зрелые вирионы. ( а ) Иммуноокрашивание анти-NP-антителом, конъюгированным с 10 нм золотыми шариками. ( б ) Иммуноокрашивание антителом против НА, конъюгированным с 10 нм золотыми шариками. ( c ) Иммуноокрашивание анти-М2 антителом, конъюгированным с 10 нм золотыми шариками. ( d ) Срезы сляба (10 нм) превирионов в процессе почкования и зрелых вирионов. Красные линии в левом и среднем столбцах указывают на мембранную область, где присутствуют вирусные спайки. Масштабная линейка, 100 нм. ( e ) Принципиальные схемы процесса упаковки RNP. Начальная (слева), средняя (в центре) и поздняя (справа) ступени почкования.

A?